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Depuis plusieurs années, une bactérie décime les populations d'ormeaux sauvages et d'élevage. Une nouvelle méthode de biologie moléculaire à la fois rapide, spécifique, sensible et quantitative a été mise au point pour détecter et quantifier les souches virulentes.

Très prisé pour son intérêt gastronomique, l'ormeau est pêché dans les populations sauvages mais aussi élevé dans des fermes aquacoles. Ses populations sont cependant en déclin car elles subissent d'importantes mortalités dues à des parasites ou des bactéries, aussi bien dans les stocks sauvages que dans les fermes. Depuis 1998, des mortalités récurrentes ont été causées en France à la fin de l’été par une bactérie, Vibrio harveyi, qui s'attaque aussi à d'autres espèces de mollusques, de crustacés et de poissons dans le monde entier. Chez l'ormeau, elle provoque un affaiblissement musculaire et l’apparition de pustules blanches sur le pied, et aboutit à une mortalité massive (jusqu’à 80 %) en quelques jours à trois semaines. Cette pathologie touche des individus en reproduction ou aux défenses immunitaires affaiblies, et ne se déclenche que si la température de l'eau dépasse 17°C ; dans un contexte de réchauffement océanique, son suivi est donc d'une grande importance.

Son étude se heurte cependant à des difficultés dues à la présence simultanée de plusieurs espèces de Vibrio qu'il n'est pas possible d’identifier de façon fiable sans mettre en œuvre des techniques de séquençage génétique très lourdes, peu adaptées à des diagnostics rapides dans un but de surveillance et de prévention dans des établissements d’aquaculture. Ce travail avait donc pour but de développer et d’évaluer une méthode rapide, spécifique, sensible et quantitative pour détecter les souches virulentes de V. harveyi dans des cultures pures, de l’eau de mer ou de l’hémolymphe, liquide dont le rôle est analogue à celui du sang.


Sk8 Hi Slim Vans Hommes Chaussures Athlétiques a50xFnPqcwL'ormeau, Haliotis tuberculata (© CNRS/E. Amice)

La technique utilisée, appelée Taqman, est une réaction en chaîne par polymérase en temps réel (PCR en temps réel). La PCR consiste à multiplier dans des proportions considérables des traces infimes d'ADN ; elle permet notamment d'amplifier certains gènes choisis pour leur rôle à des concentrations permettant leur détection. La PCR en temps réel ajoute à cette technique de base la mesure de l'abondance de ces gènes au fur et à mesure des cycles de duplication pour en déduire la quantité initiale dans l'échantillon. C'est donc une méthode qualitative (détection de la présence du gène) et quantitative (mesure de son abondance).

Deux séries d'outils spécifiques à cette technique ont été développées. La première visait à détecter et quantifier la présence de V. harveyi en ciblant une région spécifique du gène d’entretien toxR, spécifique de cette espèce. L'autre permettait de détecter et quantifier la virulence en ciblant le gène parA sur un plasmide (une des molécules d'ADN surnuméraires distinctes de l'ADN chromosomique chez les bactéries) appelé pVCR1, qui est reconnu comme porteur de la virulence. L'amplification de ces deux séquences d'ADN a été conduite simultanément, sur 17 souches bactériennes.


Schéma de principe de l'étude (d'après Renault et Schikorski, 2010)

Les résultats confirment que le gène toxR permet de détecter toutes les souches de V. harveyi, y compris les souches de référence, alors que les tests sont négatifs sur les autres espèces. De même, la méthode permet de quantifier la quantité de gènes parA présente dans l'échantillon, avec une corrélation très élevée entre le nombre de cycles d'amplification de l'ADN et la concentration bactérienne initiale. La migration des produits de l'amplification d'ADN par électrophorèse sur un gel d'agarose a permis de confirmer leur taille.

 


Visualisation des fragments d'ADN amplifié produits par la PCR en fonction de leur taille (en paires de bases), pour les gènes parA (colonne 1) et toxR (colonne 2) ; la colonne MT donne l'échelle

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique très courante, utilisée par la plupart des travaux sur la détection moléculaire rapide, sensible et spécifique des espèces du genre Vibrio, dont V. harveyi. Mesurer la concentration bactérienne dans un échantillon est possible grâce à la PCR en temps réel ; l'application de cette technique aux Vibrio était jusqu'ici limitée à quelques espèces pathogènes pour l'homme comme V. parahaemolyticus (intoxications alimentaires) ou V. cholerae (cholera). Elle ne permettait pas de distinguer V. harveyi d'espèces phylogénétiquement voisines. Cette étude est la première à l'adapter pour détecter exclusivement des souches de V. harveyi pathogènes des ormeaux : même avec un grand nombre de cycles d'amplification, aucun signal n'a été détecté pour sept espèces voisines.

La méthode utilisée est également très spécifique du gène associé à la virulence, puisque seules les deux souches dont l'infection expérimentale provoque de fortes mortalités ont été testées positives. La procédure d'extraction de l'ADN est satisfaisante, ce qui permet d'estimer de façon fiable la quantité d'ADN infectant dans l'échantillon ; on a également pu établir qu'il n'y aurait que 2 à 4 copies du plasmide pCVR1 par cellule bactérienne. Avec cette technique, le seuil de détection de V. harveyi est de 3700 cellules/ml d'eau ou d'hémolymphe, valeur beaucoup plus élevée que pour d'autres espèces de Vibrio, où il est de l'ordre de 200 cellules/ml. La sensibilité de la méthode pourrait être améliorée en développant des procédures de concentration des bactéries avant l'extraction de l'ADN. Appliquée à des échantillons d'hémolymphe (dont le prélèvement ne nécessite pas de sacrifier les animaux), cette méthode permettra de détecter V. harveyi dans les élevages d'ormeaux pour y suivre l'apparition et le développement d'épisodes de mortalité, de façon à en en limiter les conséquences économiques pour les producteurs.

 

L'article

Schikorski D., Renault T. , Paillard C., Bidault-Toffin A.PRESTO PRESTO NIKE NIKE 001 001 FLY 908019 908019 NIKE PRESTO FLY AOftwT0qw, Tourbiez D., Saulnier D., 2013. Development of TaqMan real-time PCR assays for monitoring Femmes Haute Mocassin GD Chaussure Cuir Qualité XZ045Noir40 Occasionnelles Vibrio harveyi infection and a plasmid harbored by virulent strains in European abalone Haliotis tuberculata aquaculture. Haute Cuir Mocassin Chaussure XZ045Noir40 Qualité Occasionnelles GD Femmes Aquaculture 392–395 : 106–112.

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Les auteurs

Ce travail a été mené en collaboration par des chercheurs du Lemar118 35SPM0028237 LT FIT LACOSTE LACOSTE LACOSTE FIT 118 LT 35SPM0028237 LT qCwxzAx1 (IUEM) et de l'Ifremer (Laboratoire de Génétique et Pathologie à La Tremblade, UMR Ecosystèmes Insulaires Océaniens en Polynésie).

La revue

Aquaculture est une revue internationale éditée par Elsevier depuis 1972. Elle publie des travaux sur l'élevage et la culture des organismes animaux et végétaux aquatiques (marins ou d'eau douce) : poissons, crustacés, mollusques, plantes destinées à la consommation humaine.

 

 

Contacts

Auteurs : consulter l'annuaire de l'IUEM
Service Communication et médiation scientifique : communication.iuem@univ-brest.fr


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(C) Pascale Lherminier / Ifremer

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